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    FITC標記菊粉

    來源:作者:人氣:-發表時間:2020-06-18 13:56:00【
    TdB葡聚糖衍生物
    FITC標記菊粉
    化學名稱: Inulin(3’,6’dihydroxy-3-oxospiro(isobenzofuran-1(3H) ,9’-[9H] xanthen]-5 (or 6)yl) carbamothioate
    Fluorescein isothiocyanate- Inulin
    Fluoresceinyl thiocarbamoyl- Inulin
    菊糖是一種低分子量的聚果糖,人和動物腸道外給藥時具有良好的耐受性。它被腎小球完全過濾,不被腎小管分泌或再吸收,因此被認為是測量腎小球濾過率(GFR)的金標準。
    不同來源的菊糖純化組分,分子量約為3000至5000。
    結構
    FITC標記菊粉是由異硫氰酸熒光素(FITC)與來源于大麗花塊莖的菊粉合成而成,方法如de Belder和Granath(1)所述。產品為黃色粉末,易溶于水或鹽溶液,形成黃色的溶液。稀溶液(1-2%)透明澄清,而濃溶液在靜置后會析出菊粉的結晶,結晶在加熱條件下可以重新溶解。溫度升至80°C,保持溶液近中性。該品也可溶于DMSO, 甲酰胺和其它極性有機溶劑,但不溶于短鏈脂肪醇,丙酮,氯仿,二甲基甲酰胺。
    所有批次的分子量、取代度、干燥失重和游離FITC都要檢查。TdB提供分子量為4kDa的FITC標記菊粉。
    熒光素部分通過穩定的硫代氨甲酰鍵連接,并且標記過程不會致菊糖解聚。FITC標記菊粉中,每單位果糖含有0.001-0.008 摩爾 FITC。低取代度下,電荷的影響很小。
    FITC標記菊粉分子結構示意圖
    圖1 FITC標記菊粉分子結構示意圖
    光譜數據
    FITC標記菊粉的最大激發波長490 nm,最大發射波長 520nm(見 Fig.2)。熒光強度與pH相關。pH3-9時,FITC標記菊粉溶液的熒光相關性見圖3.。 在生物介質中的測量可能會顯著地影響熒光強度,熒光強度因此得到增強或削弱。
    FITC標記菊粉的熒光吸收圖譜
    Fig. 2 pH9.0的0.025M硼酸緩沖液(13.5 mg溶于50ml緩沖液)中FITC標記菊粉的熒光吸收圖譜。最大激發波長490 nm,最大發射波長 520nm。
    FITC標記菊粉的熒光相關性
    圖3 FITC標記菊粉的熒光相關性
    物理化學性質
    FITC標記菊粉的平均重均分子量是由SEC檢測確定的(Superose 6+ 12; 葡聚糖標準品校準),大約是5000。三個批次的檢測結果分別為:5440, 5165, 5640。 使用Dionex樹脂分離得到菊粉,甚至可獲得分散度高至30的組分。缺點是該方法并不定量(2)。Phelps 使用檢測滲透壓來確定重均分子量,數值是5640 (3) 。
    當使用光散射法時,得到的重均分子量的數據是7250。值得注意的是,低分子量下,光散射法得到的數據不那么可靠。
    Marchessault和同事研究了菊糖晶體的結構,他們提出了五倍螺旋結構(4)。后來André和同事利用電子衍射技術對菊糖單晶進行了研究,發現了兩個反向平行的六重螺旋結構(5)。
    儲存和穩定性
    FITC標記菊粉在密封容器室溫下可以保存6年以上。
    室溫下密封保存,FITC標記菊粉可以穩定超過6年。穩定性與FITC標記葡聚糖類似。
    只有在較高的pH(>9)和溫度下,硫氨酰鍵才有水解的危險。和聚蔗糖一樣,由于呋喃果糖單元對酸水解的敏感性,其在酸性pH下的穩定性較差。
    毒性
    菊粉經口或靜脈測試無中毒癥狀。
    應用
    菊粉長期以來一直用于監測腎清除率。 FITC標記菊粉提供了一種簡便靈敏的實時分析方法,以替代繁瑣的化學分析。
    生物學方面及其應用
    FITC菊粉主要用于研究實驗動物腎小球濾過率(GFR),也用于研究影響其它組織透過性的因素。
    熒光測量分別提供了健康和疾病組織的傳輸和滲透性的定量數據。此類研究可以通過活體熒光顯微鏡實時進行。該技術具有高靈敏度,在組織液中可檢測到低至1微克/毫升的濃度。
    腎小球膜透過性的研究
    在大鼠股靜脈注射FITC菊粉后,測定大鼠腎小管液與血漿濃度的比值(6)。通過比較51Cr-EDTA和[H3]-菊糖,確定了該方法作為腎小球濾過率測量的有效性。Fleck在1999年(7)對FITC菊粉用于GFR研究進行了全面的調查。大鼠經尾靜脈或頸靜脈以每小時4ml/100g體重的速率給藥4mg/mL。
    Dunn和同事發現小鼠肌酐清除率(通過兩種方法)和FITC菊粉清除率(8)之間存在良好的相關性。用FITC菊粉測定小鼠GFR的兩種方法已見諸報道(9)。
    Lorenz和Gruenstein描述了一種簡單、非放射性方法,使用FITC菊粉(10)評估單個腎小球濾過率。FITC標記菊粉用于測定小鼠腎小管的液體吸收(11)。用FITC菊粉(12)研究了雄性和雌性經飲食誘導的2型糖尿病小鼠的腎功能和葡萄糖輸送。用FITC菊粉灌流法研究了單個近端小管和負鼠腎細胞(KO)。在(14-15)中,有很多KO細胞研究中,FITC菊粉作為液相內標和FITC標記白蛋白作為受體介導的內標。測定了腎上皮細胞Ca+開關前后FITC標記菊粉的輸送率變化(16)。最近,FITC標記菊粉用于評估生物人工腎裝置的屏障功能(17,18)。
    其他細胞透過性研究
    FITC菊粉對腸上皮細胞單層透過性的研究(19)已見諸報道。Neunlist和同事使用FITC標記菊粉和FITC標記葡聚糖研究腸上皮細胞單層的透過性(20)。照射后2~24小時,用FITC標記菊粉(21)通過免疫熒光顯微鏡觀察結腸上皮緊密連接(TJ)、貼壁連接(AJ)和肌動蛋白細胞骨架的完整性。FITC標記菊粉在肝臟和腸道組織破壞的研究中也很有價值(22)。
    葡聚糖和FITC標記葡聚糖具有牛頓流體特征,例如粘度與剪切速率無關(圖4)。在pH4-10范圍的研究顯示,粘度與pH無關。 在pH8-9和6.5-9.5下,經電泳,FITC標記菊粉的等電點未發生遷移(1)。
    產品列表
    產品編號
    品名
    分子量(kDa)
    包裝
    FITC標記菊粉
    4500
    100 mg
    1 g
    5 g
    參考文獻
    1. A.N.de Belder and K.Granath. Preparation and properties of fluorescein-labelled dextrans. Carbohydr Res.1973;30:375-378.
    2. C.Fleck. Determination of the glomerular filtration rate (GFR); Methodological problems, age-dependen- ce, consequences of various surgical interventions, and the influence of different drugs and toxic sub- stances. Physiol Res.1999; 48:267-279.
    3. C.F.Phelps. The physical properties of inulin solu- tions. Biochem J. 1965;95:41-47.
    4. R.H.Marchessault, T.Bleha, Y.Deslandes et al. Con- formation and crystalline structure of (2-1)-α-D-fructofuranan(inulin). Can J Chem. 1980;58:2415-2421.
    5. I.André, K.Mazeau, I.Tvaroska et al. Molecular and crystal structures of inulin from electron diffractional data. Macromolecules. 1996;29:4626-4635.
    6. M.Sohtell, B.Karlmark and H.Ulfendahl. FITC-in- ulin as a kidney tubule marker. Acta Physiol Scand. 1983;119:313-6.
    7. C.Fleck, Determination of the glomerular filtration rate(GFR); Methological problems, Age-dependence, consequence of various surgical interventions and the influence of different drugs and toxic substances. Physiol Res.1999;48:267-279.
    8. S.R.Dunn, Z.Qi, E.P.Bottinger et al., Utility of endo- genous creatinine clearance as a measure of renal function in mice. Kidney Int. 2004;65:1959-67.
    9. Z.Qi, I.Whitt, A.Mehta et al. Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance. Am J Physiol Renal Physiol. 2004;286:F590-6.
    10. J.N.Lorenz and E.Gruenstein. A simple, non radio- active method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin. Am J Physiol. 1999;276:F172-7.
    11. J.Ba, D.Brown and Friedman. Calcium- sensing receptor regulation of PTH-inhibitable proximal tubule phosphate transport. Am J Physiol Renal Physiol. 2003;285: F1233-43.
    12. W.T.Noonan and R.O.Banks. Renal function and glucose transport in male and female mice with diet induced type II diabetes mellitus. Proc Soc Exp Biol Med. 2000; 225: 221-30.
    13. J.S.Schwegler, B.Heppelmann, S.Mildenberger et al. Receptor-mediated endocytosis of albumin in cultured opossum kidney cells: a model for a prox- imal tubular protein reabsorption. Pfluegers Arch. 1991;418:383-92
    14. M.Takano, N.Nakaanishi, Y.Kitahara et al. Cispla- tin-induced inhibition of receptor-mediated endocyto- sis protein in the kidney. Kidney int. 2002;62:1707-17.
    15. Y.Sasaki, J.Nagai, Y.Kitahara et al. Expression of chloride channel, C1C-5, and its role in receptor mediated endocytosis of albumin in OK cells. Biochem Biophys Res Commun. 2001;282:212-8.
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